Après avoir suivi différents cours de théâtre et embrassé une carrière de danseuse de cabaret, Florence Thomassin se dirige vers le septième art dans les années 80 en interprétant des petits rôles. En 1995, dans Elisa de Jean Becker, elle se distingue dans le rôle de la mère de Vanessa Paradis, avant de se faire remarquer en croqueuse d’hommes dans Ainsi soient-elles.

Florence Thomassin passe de femme très sensuelle à femme fragile, nommée aux Césars dans la catégorie Meilleur second rôle féminin pour Une Affaire de Gout de Bernard Rapp en 2000. Après avoir remporté le prix de la meilleure comédienne au Festival de Saint Tropez pour le téléfilm Les Vilains de Xavier Durringer, elle joue dans Le Coeur des hommes, , amoureuse de Jean-Pierre Darroussin.

Elle impose en voix off son timbre troublant dans  Un long dimanche de fiançailles de Jean-Pierre Jeunet, . En 2006, c’est la consécration, elle est à l’affiche de Président, du Grand Meaulnes et du polar sombre Ne le dis à personne de son ami Guillaume Canet.

Prostituée violentée dans Mesrine : L’Instinct de mort (2008), Marquise de Mézières de Bertrand Tavernier dans La Princesse de Montpensier, Florence Thomassin navigue de rôle en rôle sur petits et grands écrans.